对冻干菌复苏的同时制备部分悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。
1、冻存保护液（40%无菌甘油）及灭菌冻存管。
2、细菌冻存液：由液体培养基与冻存保护液按1:1比例混匀制成。
将冻干菌复溶后，吸取菌县液加入到细菌冻存液中混匀。
按1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-20或80度条件下冷冻保存。
制备第2代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第1代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长的纯菌落，再接种至细菌冻存液中，混匀后冻存。
